غالباً حجم مورد نیاز از نمونه مورد آزمایش نیز خیلی كم و حدود 100 میكرولیتر می‌باشد. در مورد دقت آن نیز باید گفت كه قادر است تعداد 1 سلول سرطانی در میان 10000 تا 100000 سلول عادی موجود در نمونة مغز استخوان را شناسایی كند. فلوسایتومتری در بخش‌های تحقیقاتی و در آزمایشگاه‌های تشخیصی كاربرد وسیعی دارد و برای تشخیص بیماری‌ها، تعیین پیش آگهی و هم برای ارزیابی درمان بدخیمی‌ها كاربرد دارد.

این روش بر خصوصیات پراكنده سازی نور توسط سلول‌ها (شكل 1) و نیز بر نشر فلورسانس از آنها (شكل 2) استوار است. نشر فلورسانس می‌تواند با استفاده مستقیم از مواد رنگ‌كننده فلورسنت حاصل می‌شود (مثل رنگ كننده‌های DNA یا RNA كه هم خصوصیت فلورسانس بودن را دارا هستند و هم خود انتخاب می‌كنند كه به كدام جزء سلولی متصل شوند) یا تركیبی از رنگ فلورسنت با آنتی‌بادی‌های مونوكلونال تحت نام عمومی كونژوگه مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این حالت انتخاب محل اتصال به سلول، توسط جزء آنتی‌بادی موجود در كونژوگه صورت می‌گیرد و این آنتی‌بادی است كه به صورت كاملا اختصاصی آنتی‌ژن هدف را بر روی سلول یا در داخل آن شناسایی كرده و به آن متصل می‌شود و جزء فلورسنت موجود در كونژوگه ابزاری برای ردیابی محل و میزان آنتی‌بادی‌های متصل شده به هدف می‌باشد.

اگر چه سلول‌ها بخودی‌خود دارای فلورسانس اندكی در برخی طول موج‌ها هستند اما بدون بكارگیری نور تهییج كننده كه غالباً لیزر می‌باشد هیچ سیگنالی تولید و به ردیاب‌های دستگاه ارسال نخواهد شد. سیگنال‌های ردیابی شده توسط دستگاه یا از منشاء نور لیزر دستگاه می‌باشد كه پس از برخورد به سلول در جهات مستقیم (forward scatter) یا عمود بر محور تابش لیزر (side scatter) پراكنده شده و به ردیاب‌ها می‌رسد و یا از منشاء فلوروكروم متصل به سطح ذره می‌باشد. فلوروكروم‌های متصل شده به سطح یا داخل سلول بر اثر تابش نور لیزر تهییج شده و انرژی نور تابیده شده را جذب كرده و سپس در طول موج دیگری به صورت تابش فلورسانس آزاد می‌سازند.

شكل 1

شكل 2

سلول‌ها از اجزاء مختلفی مثل غشاء سیتوپلاسمی، غشاء هسته‌ای، هسته و سیتوپلاسم تشكیل می‌شود و تقریبا همه مولكول‌های موجود در قسمت‌های مختلف سلول را می‌توان با استفاده از فلوسایتومتری ردیابی و تعیین مقدار نمود. معمولاً مولكول‌های سطحی موجود در غشاء سیتوپلاسمی براحتی در دسترس آنتی‌بادی قرار می‌گیرند ولی برای رسیدن آنتی‌بادی یا مادة فلورسانس به مولكول‌های درونی سلول روش‌های مطمئن و موثری لازم است.

هر سلولی بر حسب نوع و تخصصی كه به عهده دارد مولكول‌های مختص به خود را بیان می‌كند، بدین معنی كه همة ژن‌ها در همة سلول‌ها بیان نمی‌شوند بلكه برحسب وظیفه‌ای كه در طی تمایز بر عهدة سلول گذاشته شده است و بر حسب محیطی كه در آن قرار می‌گیرد هر سلولی خود انتخاب می‌كند كه در پاسخ به شرایط محیطی كدام ژن را فعال سازد. بنابر این ردیابی پروتئین‌های سلولی حاصل از بیان ژن‌ها هم در سطح و هم در درون سلول می‌تواند وسیله‌ای بسیار مفید برای شناسایی سلول باشد.

مولكول‌های سطحی سلول‌ها تحت نام عمومی CD كه مخفف Cluster Differentiation می‌باشد شناخته می‌شوند و برای ردیابی آنها از آنتی‌بادی‌های منوكلونال كونژوگه با فلوروكروم استفاده می‌شود. مثلا ماركرهای سطحی سلولهای NK عبارتند از CD16 و CD56 كه آنتی‌بادی‌هایی با همین نام قادرند این مولكول‌ها را در سطح سلول شناسایی نمایند. اغلب لفظ آنتی‌بادی در گفتار یا نوشتار حذف می‌شود مثلاً كونژوگه CD16 همان آنتی‌بادی شناسایی كننده CD16 می‌باشد كه متصل به فلوروكروم است. یا كونژوگه CD34 اشاره به آنتی‌بادی شناسایی كنندة CD34 دارد كه با فلوروكروم مناسبی كونژوگه شده است (CD34 ماركر اختصاصی سلول‌های ریشه‌ای تمایز نیافته مغز استخوان می‌باشد).

با استفاده از فلوسایتومتری محصولات پروتئینی ژن‌ها در داخل سلول نیز قابل ردیابی هستند و نامگذاری آنتی‌بادی‌های مورد استفاده براساس نام پروتئین مورد نظر صورت می‌گیرد. مثلاً پروتئین Zap-70 ساروگیت ماركر برای موتاسیون‌های ناحیه متغیر زنجیره سنگین ایمونوگلوبولین می‌باشد و در تعیین زیر گروه‌های CLL اهمیت دارد و توسط آنتی بادی با همین نام قابل شناسایی است.

فلوسایتومترهای اولیه قادر بودند فقط یك یا دو رنگ فلورسانس را تجزیه و تحلیل كنند اما امروزه دستگاه‌هایی عرضه شده‌اند كه قادرند یازده رنگ فلورسانس را به طور هم‌زمان ردیابی و تجزیه و تحلیل كنند. اساس و نحوة كار فلوسایتومتر بحث پایه‌ای برای درك روش‌های مختلف فلوسایتومتری است.

برای انجام فلوسایتومتری لازم است كه ابتدا سلول‌ها با فلوروكروم‌ها نشاندار شوند. از طرفی برای نشاندار كردن اجزاء داخلی سلول باید اقدامات خاصی را انجام داد تا آنها در دسترس آنتی‌بادی یا ماده فلورسنت قرار گیرند روش‌های رنگ‌آمیزی با فلوروكروم‌ها و استفاده از مواد نفوذپذیر كننده متنوع برای نفوذپذیر كردن سلول‌ها خود بحث دیگری است كه باید جداگانه به آن پرداخته شود.

تعداد فلوروكروم‌های مورد استفاده برای فلوسایتومتری در طی سالیان متمادی مرتباً افزایش یافته است و این احتمال وجود دارد كه در آینده، تعداد فلوروكروم‌های مورد استفاده برای آنالیز سلول‌ها بیش از این نیز افزایش یابد. شناخت انواع فلوروكروم‌ها و آگاهی از مزیت‌ها و معایب هر كدام تنها راه استفاده بهینه از آنها برای دستیابی به مقاصد علمی تحقیقاتی است.

برای انجام هر نوع فلوسایتومتری ابتدا باید سلول‌ها را آماده كرد به طوری كه سلول‌ها به صورت تكی در آمده و در محیط مناسبی معلق شده باشند. بعضاً یك مرحله تخلیص برای بالا بردن غلظت سلول‌های مورد نظر در نمونه ضرورت پیدا می‌كند روش‌های مختلفی برای تهیه، تخلیص و آماده سازی سلول وجود دارند و روش انتخاب شده به نوع سلول مورد ارزیابی بستگی دارد.

پس از تهیه سوسپانسیون مناسب، سلول‌ها باید با مواد فلورسانس رنگ شوند و یا با آنتی‌بادی‌های كونژوگه با فلوروكروم نشاندار شوند. روش نشانداركردن تحت تاثیر فاكتورهای زیادی قرار می‌گیرد از جمله: میزان اختصاصی بودن آنتی‌بادی و غلظت آنتی‌ژن در سطح یا داخل سلول، مناسب بودن غلظت آنتی بادی مورد استفاده و به کار بردن كنترل‌های مثبت و منفی مناسب در آنالیز سلول‌ها.

داشتن برنامه‌های كنترل كیفی برای روش‌ها و تجهیزات در هر نوع فلوسایتومتری ضروری بوده و یك نیاز اساسی محسوب می‌گردد. این برنامه‌ها برای اطمینان از كیفیت نتایج بدست آمده به كار برده می‌شوند. همچنین برنامه‌های كنترل كیفی بایستی مرتباً و در حد كفایت انجام شوند تا تشخیص نقاط اشكال به آسانی ممكن گردد. بدین منظور، برنامة كنترل كیفی در هر دو زمینة، كنترل كیفی داخلی و روش‌های ارزیابی كیفی خارجی، باید به اجرا گذاشته شوند.

در فلوسایتومتری طی دو مرحلة جمع‌آوری اطلاعات و مرحلة آنالیز اطلاعات امكان خطا وجود دارد كه با به كارگیری روش صحیح تهیة نمونه سلولی و تنظیم دقیق دستگاه می‌توان از خطاهای مربوط به مرحلة جمع‌آوری اطلاعات جلوگیری كرد اما توانایی اپراتور در طراحی صحیح آزمایش، تنها جنبه‌ای از كسب اطلاعات است كه برای آن روش‌های كنترل خطا وجود ندارد. بدین معنی كه انتخاب آنتی‌بادی مناسب و انتخاب فلوروكروم متناسب با غلظت و موقعیت آنتی‌ژن نیازمند تجربیات و اطلاعاتی است كه باید توسط محقق كسب شوند.

آپوپتوز یكی از شكل‌های مرگ سلول می‌باشد كه از نظر بیولوژی اهمیت زیادی دارد و به همین دلیل ردیابی و اندازه‌گیری آپوپتوز در تحقیقات و موارد بالینی اهمیت پیدا می‌كند. سلول‌های در حال آپوپتوز نشانه‌های زیادی دارند كه قابل اندازه‌گیری با فلوسایتومتری می‌باشند این نشانه‌ها عبارتند از تغییرات در غشاء پلاسمائی سلول، تغییرات در نفوذپذیری غشاء پلاسمائی، تغییرات در نفوذپذیری غشاء میتوكندری، فعال‌سازی كاسپازها و شكستگی‌های DNA سلولی. شناسایی هر یك از این تغییرات به تنهایی یا تركیبی از آنها به وسیلة فلوسایتومتری، امكان شناسایی و اندازه‌گیری سلول‌های آپوپتوتیك را از میان مخلوطی از سلول‌های دیگر فراهم می‌كند همچنین اطلاعات با ارزشی در بارة مسیر مولكولی مرگ سلول‌ها به دست می‌آید.

دسترسی به رنگ‌های فلورسنتی که به صورت خطی و متناسب با غلظت به DNA سلولی متصل می‌شوند فلوسایتومتری را برای آنالیزDNA توانمند ساخته است. امروزه تعیین کمی مقدار DNA، شناسایی سلول‌های دیپلوئید نرمال در حالت استراحت، شناسایی سلول‌هایی كه به طور فعال DNA سنتز می‌كنند و شناسایی سلول‌هایی كه در مرحلة پیش میتوز و یا میتوز هستند توسط فلوسایتومتر امكان پذیر شده است. هنگامی كه فازهای مختلف چرخة زندگی سلول‌ها مشخص شدند، می‌توان با توام‌كردن روش‌های ردیابی پروتئین‌های مؤثر در چرخة سلولی به وسیلة آنتی‌بادی‌های اختصاصی و روش تعیین مقدار DNA بیان پروتئین‌ها را در فازهای مختلف زندگی سلول‌ها بررسی كرد. اضافه‌نمودن آنالوگ تیمیدین یا بروموداکسی یوریدین به محیط كشت سلولی امكان شناسایی سلول‌هایی را فراهم می‌كند که فعالانه در حال سنتز DNA هستند. با استفاده از روش تعیین مقدار DNA همچنین می‌توان تعداد کروموزوم‌ها (هنجار یا ناهنجار) را مشخص كرد. سلول‌هایی كه به حالت پلوئیدی (برای مثال در مگاکاریوسیت‌ها) و یا آناپلوئیدی (برای مثال در بیماری‌های بدخیم) می‌باشند نیز با این روش قابل شناسایی هستند.

روش فلوسایتومتری در سایة افزایش روزافزون تعداد آنتی‌بادی‌ها، تترامرها و رنگ‌های تولید شده برای استفاده در ارزیابی فعالیت سلول‌ها به عنوان یك ابزار مهم در مطالعة سلول‌های سیستم ایمنی در آمده است. فلوسایتومتری چند رنگی این امكان را فراهم آورده است كه انواع سلول‌های موجود در نمونة خون یا سلول‌های كشت شده به تفكیك مورد ارزیابی قرار گیرند. سلول‌های تحت مطالعه با استفاده از آنتی‌بادی‌های اختصاصی معرف زیر گروه‌های سلولی، شناسایی می‌شوند و خصوصیات رفتاری آنها نیز با استفاده از آنتی‌بادی‌های اختصاصی (مثلاً ضد سایتوكین) و یا رنگ‌های ارزیابی كنندة حیات سلولی تعیین می‌شوند. با استفادة هم‌زمان از دو روش آنالیز سلولی و جداساز سلولی (cell sorter) امكان مطالعة بیشتر و كشت سلول‌های كاملاً شناخته شده از نظر فنوتایپی یا رفتاری فراهم می‌گردد.

در حضور یون‌های کلسیم خصوصیات طیفی برخی از رنگ‌های فلورسنت تغییر می‌یابد. از این رنگ‌ها برای اندازه‌گیری تغییرات غلظت كلسیم اجزاء سلولی در هنگامی ‌که سلول‌ها بوسیله انواع محرک‌ها تحریک می‌شوند استفاده می‌شود.

بیشترین مورد استفاده از فلوسایتومتری ارزیابی آنتی‌ژن‌های سطحی بیان‌شده بر روی سلول‌ها می‌باشد. اما علاوه بر آن سلول‌ها ممکن است با روش‌های مختلف برای اندازه‌گیری خصوصیات عملکردی بوسیلة فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گیرند. می‌توان تغییرات زمانی بیان گیرنده‌ها را تعیین كرد یا برهمكنش یک نوع سلول را با سلول دیگر اندازه‌گیری نمود. بعلاوه، امكان ارزیابی تغییرات در فعالیت آنزیم‌ها و پتانسیل غشایی وجود دارد. همچنین می‌توان آزمایشاتی برای نشان دادن فاگوسیتوز و آزادسازی مولکول‌های فعال زیستی (bioactive) انجام داد.

روش جداسازی سلول‌ها با استفاده از خصوصیات فلورسانس آنها توسط ایمونولوژیست‌هایی ابداع شد كه تلاش می‌كردند جمعیت‌های خالص سلول‌ها را از نمونه‌های مختلط تهیه كرده و پس از تكثیر آنها در محیط كشت سلولی، نقش مجزای هر سلول را در سیستم ایمنی بررسی نمایند. روشی كه آنها به كار بردند Fluorescence Activated Cell Sorting یا به طور خلاصه FACS نامیده شد. جداسازهای جریانی (flow sorter) وسایلی ضروری و پرطرفدار در علوم بیولوژیكی و علوم دیگر هستند. كارآیی اصلی این جداسازها، چنانچه از نامشان بر می‌آید، جدا كردن جمعیت‌های سلولی دلخواه از میان جمعیتی هتروژن از سلول‌ها برای مطالعة بیشتر می‌باشد. بطور كلی اگر سلول یا ذره‌ای دارای خصوصیات منحصر به فردی از نظر فیزیكی یا شیمیایی باشد با استفاده از آن خصوصیات می‌توان براحتی آن را شناسایی كرده و توسط flow sorter از دیگر سلول‌های همراه جدا كرد.

مبحث مهم دیگر نرم افزارهای مورد استفاده در فلوسایتومتری هستند. در اوایل، دستگاه‌های فلوسایتومتر اطلاعات سلولی جمع‌آوری شده توسط دستگاه را با فرمت خاصی ذخیره می‌كردند كه استفاده مجدد از اطلاعات ذخیره شده در كامپیوترهای معمولی (PC) غیرممكن می‌شد، اما امروزه نسل سوم استانداردهای فایل فلوسایتومتری (FCS3) تنظیم و تصویب شده است و رعایت این استانداردها توسط تولید كنندگان دستگاه‌ها سبب شده است تا فایل‌های اطلاعات ذخیره شدة فلوسایتومتری كاربرد عمومی‌تری پیدا كند. نرم افزارهای مورد استفاده می‌توانند برای جمع‌آوری اطلاعات و پردازش آنها، ترسیم نمودارهای یك، دو یا سه بعدی از اطلاعات و یا برای انجام محاسبات ریاضی و آماری بر روی اطلاعات به كار برده شوند. معرفی انواع نرم افزارهای رایج برای باز كردن و مدیریت فایل‌های فلوسایتومتری و محاسن و محدودیت‌های هر كدام نیازمند مجالی دیگر است.

                                                                                  نوشته شده توسط جابر ظفری