تبلیغات
سم شناسی دانشگاه تربیت مدرس - کروماتوگرافی
چهارشنبه 11 آبان 1390

کروماتوگرافی

   نوشته شده توسط:    

 

نوشته شده توسط: عماد جعفرزاده

کروماتوگرافی بر اصول کل پخش فاز بنیان نهاده شده است. به طور خلاصه، در این روش جریان یک فاز از کنار (یا از داخل) فاز ساکنی میگذرد و در این حال فاز ساکن اجزای آنرا به طور انتخابی خارج میکند. این خروج یک عمل تعادلی است و مولکولهای اجزاء دوباره داخل فاز متحرک میشوند. هنگامی که ثابت پخش دو یا چند جزء در این دو فاز با هم متفاوت باشند، اجزای مربوط در فاز متحرک میشوند. هنگامی که ثابت پخش دو یا چند جزء در این دو فاز با هم متفاوت باشند، اجزای مربوط در فاز متحرک از هم تفکیک میشوند. به طور ساده میتوان گفت که هر چه فاز ساکن یک جزء را محمتر نگه دارد، در صد مولکولهای جزئی که بی حرکت نگه داشته شده بیشتر میشود. جزء دیگری که با شدت کمتر نگه داشته میشود نسبت به جزء اول در فاز متحرک درصد مولکولی بیشتری خواهد داشت. بنابراین به طور متوسط مولکولهای جزئی که با شدت کمتر نگه داشته میشوند، نسبت به مولکولهای دیگر با سرعت بیشتری از روی فاز ساکن میگذرند (در جهت جریان) و در نتیجه اجزای مربوط به قسمتهای مختلف فاز ساکن (باندها) منتقل میشوند

جریان) و در نتیجه اجزای مربوط به قسمتهای مختلف فاز ساکن (باندها) منتقل میشوند.
فاصله باندها به طور خطی به مسافتی که در ستون طی میشود بستگی دارد. به طور کلی هر چه مسافت طی شده بیشتر باشد، فاصله باندها زیادتر خواهد شد. یادآور میشود که اجزای مخلوط باید ضرایب پخش متفاوتی داشته باشند تا بتوان آنها را به کمک پخش فاز تفکیک کرد. در صورتی که این ضرایب به هم نزدیک باشند، اجزای مربوط فقط به طور جزئی به باندهای جداگانه تفکیک میشوند. البته میتوان طول مسیر را زیاد کرد و به اجزاء فرصت داد تا بیشتر از هم جدا شوند.
کروماتوگرافی چهار نوع مهم دارد که بر اصول توصیف شده بالا متکی هستند. این انواع عبارتند از کروماتوگرافی گازی (کروماتوگرافی تفکیکی گاز مایع)، کروماتوگرافی ستونی، کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) و کروماتوگرافی کاغذی.


كروماتوگرافی ستونی

در كروماتوگرافی ستونی جسم بین فازهای مایع و جامد پخش میشود. فاز ساكن جسم جامدی است و این جسم اجزای مایعی را كه از آن میگذرد به طور انتخابی در سطح خود جذب میكند و آنها را جدا میكند. اثرهایی كه باعث جذب سطحی میشوند همان اثرهایی هستند كه موجب جذب در مولكولها میشوند. این اثرها عبارتند از: جاذبه الكترواستاتیكی، ایجاد كمپلكس، پیوند هیدروژنی، نیروی واندروالس و غیره.
برای جدا كردن یك مخلوط با كروماتوگرافی ستونی، ستون را با جسم جامد فعالی (فاز ساكن) مانند آلومینا یا سیلیكاژل پر میكنند و كمی از نمونه مایع را روی آن میگذارند. نمونه ابتدا در بالای ستون جذب میشود. سپس حلال استخراج كننده ای را در داخل ستون جریان میدهند. این فاز مایع متحرك، اجزای مخلوط را با خود میبرد. ولی به علت نیروی جاذبه انتخابی فاز جامد، اجزای مربوط میتوانند با سرعتهای مختلفی به طرف پایین ستون حركت كنند. تركیبی كه با نیروی كمتری جذب فاز ساكن شود سریعتر خارج میشود زیرا كه درصد مولكولی آن در فاز متحرك از تركیبی كه با نیروی زیادتری جذب فاز ساكن میشود بیشتر است.
اجزای تفكیك شده را میتوان مجددا به دو روش به دست آورد:
1)
مواد جامد ستون را میتوان خارج كرد و قسمتی از آنرا كه حاوی باند مورد نظر است برید و با حلال مناسب استخراج كرد.
2)
چون باندها با زمانهای مختلفی خارج میشوند میتوان آنقدر حلال را از ستون عبور داد تا باندها از انتهای آن خارج شوند و در ظرف جداگانه ای بریزند.
معمولا روش دوم كاربرد بیشتری دارد.
در مورد اجسام رنگین میتوان باندهایی را كه به طرف پایین ستون می آیند مستقیما مشاهده كرد.

اما در مورد اجسام بیرنگ نمیتوان تغییرات را مستقیما مشاهده كرد. با این حال بسیاری از اجسام در هنگام تابش نور ماورای بنفش فلوئورسانس پیدا میكنند و در چنین مواردی از این خاصیت جهت مشاهده باندها استفاده میشود. معمولا برای پی بردن به جریان عمل كروماتوگرافی ستونی حجمهای كوچك و ثابتی (مثلا 25 میلی لیتر) از محلول استخراج شده را جمع آوری میكنند. سپس حلال آنها را تبخیر میكنند تا ببینند جسمی در آنها وجود دارد یا خیر. گرچه ممكن است یك جسم در چند ظرف پخش شود، ولی اگر حجم هر جزء نسبتا كم گرفته شود (مثلا كمتر از 10% حجم ستون) معمولا باندهای مختلف در ظروف مختلف جمع آوری میشوند. روش دیگری كه برای پی بردن به وضع تفكیك مناسب است آن است كه محلول استخراج شده در فاصله زمانی مختلف با كروماتوگرافی لایه نازك مورد بررسی قرار گیرد.
تعدادی از جاذبهای جامدی كه عموما مصرف میشوند عبارتند از: آلومینا، سیلیكاژل، فلورسین، زغال چوب، منیزیم اكسید، كلسیم كربنات، نشاسته و شكر. معمولا شیمیدانهای آلی از آلومینا، سیلیكاژل و فلورسین بیشتر استفاده میكنند.
آلومینا (Al2O3) تركیب قطبی بسیار فعالی است كه قدرت جذب زیادی دارد و به سه صورت موجود است: خنثی، شسته شده با اسید و شسته شده با باز. آلومینای بازی برای تركیبهای اسیدی و آلومینای اسیدی برای تركیبهای بازی قدرت تفكیك خوبی نشان میدهد. در تركیبهایی كه به شرایط اسیدی و بازی حساسیت دارند و واكنش شیمیایی دارند باید از آلومینای خنثی استفاده كرد. آلومینا با قطبیت زیادی كه دارد تركیبهای قطبی را به شدت جذب میكند و در نتیجه ممكن است استخراج آنها از ستون را مشكل كند. فعالیت (قدرت جذب) آلومینا را میتوان با افزایش كمی آب كاهش داد، درجه فعالیت آلومینا با درصد وزنی آب موجود مشخص میشود. سیلیكاژل و فلورسین هم قطبی هستند ولی قطبیت آنها از آلومینا كمتر است.
برای اینكه جاذبهای جامد نیروی موثر تری داشته باشند، باید اندازه ذرات آنها یكنواخت و سطح مخصوص آنها زیاد باشد. چنین سطحی باعث تسریع تعادل جسم در دو فاز میشود. این حالت در ایجاد باندهای باریك اهمیت دارد.
در تعیین شرایط یك تجربه كروماتوگرافی باید به ماهیت فاز مایع (حلال) مصرفی توجه كرد. حلال نیز میتواند در جسم جامد جذب شود و به این وسیله برای جذب مواضع جذبی كه در سطح جامد وجود دارند، با جسم حل شده رقابت كند. چنانچه حلال قطبی تر باشد و شدیدتر از اجزای مخلوط جذب شود، تقریبا تمام اجزاء در فاز مایع متحرك باقی میمانند و تفكیكی كه در ضمن تجربه صورت میگیرد ناچیز خواهد بود. در نتیجه برای این كه تفكیك خوب انجام شود باید قطبیت حلال استخراجی به طور قابل ملاحظه ای كمتر از اجزای مخلوط باشد. به علاوه باید اجزای مخلوط در حلال حل شوند، زیرا در غیر این صورت اجزا به طور دایم در فاز ساكن ستون جذب میشوند و در آن باقی میمانند. قدرت استخراجی حلالهای مختلف (یعنی توانایی آنها در انتقال یك جسم معین به پایین ستون) بترتیب زیر از بالا به پایین زیاد میشود:
هگزان
كربن تترا كلرید
تولوئن
بنزن
دی كلرومتان
كلروفرم
اتیل اتر
اتیل استات
استون
پروپانول
اتانول
متانول
آب
در یك كروماتوگرافی ستونی ساده نمونه را در بالای ستون میگذارند و در طول تفكیك از حلال واحدی استفاده میكنند. بهترین حلال انتخابی، حلالی است كه بیشترین فاصله را در باندها ایجاد كند. چون احتمالا بهترین حلال در اثر تجربه بدست می آید، گاهی راحتتر است كه در انتخاب حلال برای كروماتوگرافی ستونی از روش كروماتوگرافی لایه نازك استفاده شود. تعداد زیادی از تجربه های كروماتوگرافی لایه نازك را میتوان با استفاده از حلالهای مختلف، در زمان نسبتا كوتاهی انجام داد. معمولا بهترین حلال یا مخلوط حلالی كه به این روش به دست می آید برای كروماتوگرافی ستونی مناسب است.
معمولا از روشی كه به استخراج تدریجی (یا جزء به جزء) معروف است استفاده میشود. در این روش برای ظهور كروماتوگرام از یك سری حلالهایی استفاده میكنند كه قطبیت آنها مرتبا رو به افزایش میرود. در شروع با یك حلال غیر قطبی (معمولا هگزان) ممكن است یك باند به طرف پایین ستون حركت كند و از آن خارج شود و در این حال باندهای دیگر در نزدیكی ابتدای ستون باقی بمانند. سپس حلالی كه قطبیت آن اندكی بیشتر است به كار میبرند. در حالت ایده آل باید یك باند دیگر خارج شود و در این حال بقیه باندها در عقب آن باقی بمانند. چنانچه قطبیت حلال یكباره زیاد بالا رود، ممكن است تمام باندهایی كه باقی مانده اند یكباره از ستون خارج شوند. بنابر این باید در هر مرحله قطبیت حلال به مقدار كم و با قاعده معینی افزایش یابد. بهترین راه انجام این كار آن است كه از حلالهای مخلوط استفاده شود و تعویض كامل حلال چندان مناسب نسیت.
طریقه پر كردن ستون بسیار اهمیت دارد زیرا ستونی كه خوب پر نشود اجزاء را هم خوب تفكیك نمیكند. جسم پرشده باید همگن باشد و در آن هوای محبوس یا حباب بخار وجود نداشته باشد.


کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)

کروماتوگرافی لایه نازک نوعی کروماتوگرافی جذبی جامد – مایع است و اصول آن مانند کروماتوگرافی ستونی است. ولی در این مورد جسم جاذب جامد را به صورت یک لایه نازک در روی یک قطعه شیشه یا پلاستیک محکم پخش میکنند. یک قطره از محلول نمونه یا مجهول را در نزدیکی لبه صفحه میگذارند و صفحه را همراه مقدار کافی از حلال استخراج کننده در ظرفی قرار میدهند. مقدار حلال باید آنقدر باشد که فقط به سطح زیر لکه برسد (شکل الف). حلال به طرف بالای صفحه میرود و اجزاء مخلوط را با سرعتهای متفاوت با خود میبرد. در نتیجه ممکن است تعدادی لکه روی صفحه ظاهر شود. این لکه ها روی یک خط عمود بر سطح حلال ظرف قرار میگیرند (شکل ب).
 
این روش کروماتوگرافی بسیار آسان است و به سرعت هم انجام میشود. این روش برای تفکیک اجزاء یک مخلوط بسیار مفید است و همچنینی میتوان از آن برای تعیین بهترین حلال استخراج کننده جهت کروماتوگرافی ستونی استفاده کرد.
در TLC میتوان از همان مواد جامد که در کروماتوگرافی ستونی استفاده میشود استفاده کرد و در این میان سیلیکا و آلومینا بیشتر به کار میرود. معمولا جسم جاذب را با مقدار کمی از ماده نگهدارنده مانند گچ شکسته بندی، کلسیم سولفات و یا نشاسته مخلوط میکنند تا جسم جاذب چسبندگی لازم را پیدا کند و به صفحه بچسبد. صفحه ها را میتوان قبل از مصرف تهیه کرد و یا از ورقه های پلاستیکی آماده که در بازار موجود است استفاده نمود.
یکی از مزایای مشخص TLC آن است که احتیاج به مقدار بسیار کمی از نمونه دارد. در بعضی موار میتوان تا مقدار 9-10 گرم را تشخیص داد. اما ممکن است اندازه نمونه تا 500 میکرو گرم برسد. در نمونه های زیاد میتوان از تجربه های تهیه ای استفاده کرد. در این تجربه ها لکه های مختلف را میتراشند و با یک حلال مناسب میشویند (استخراج میکنند). و برای شناسایی (از طریق طیف سنجی) به کار میبرند.
تشخیص لکه های رنگین در روی کروماتوگرام آسان است و برای تعیین محل لکه های اجسام بیرنگ روشهای متعددی وجود دارد. برای مثال میتوان با تابش نور ماوراء بنفش به صفحه محل لکه، ترکیبهایی را که خاصیت فلوئورسانس دارند مشخص کرد. به روش دیگر میتوان جسم جاذب را با ماده فلوئورسانس دار بی اثر دیگری مخلوط کرد. هنگامی که نور ماوراء بنفش به این صفحه بتابد، لکه اجسامی که نور ماورای بنفش را جذب می کنند ولی خاصیت فلوئورسانس ندارند در زمینه فلورسانس دار صفحه به صورت تیره رنگ ظاهر میشوند. در بسیاری موارد دیگر، از معرفهای آشکارساز دیگری استفاده میکنند. این معرفها را میتوان بر روی کروماتوگرام پاشید و لکه ها را ظاهر کرد. سولفوریک اسید، که بسیاری از ترکیبات آلی را به ذغال تبدیل میکند و محلول پتاسیم پرمنگنات نمونه هایی از معرفهای آشکار ساز هستند که به این روش مصرف میشوند. ید نیز معرف آشکار ساز دیگری است که مصرف میشود. در این مورد صفحه را دز ظرفی میگذارند که محیط آن از بخار ید اشباع باشد. بسیاری از ترکیبات آلی ید را جذب میکنند و لکه آنها روی کروماتوگرام رنگین (معمولا قهوه ای) میشود.
در شرایط معین سرعت حرکت ترکیب نسبت به سرعت پیشرفت حلال (Rf) خاصیت مشخصی از ترکیب است. برای تعیین این مقدار مسافتی را که جسم از خط شروع تا وسط لکه را طی کرده است اندازه میگیرند و آنرا به مسافتی که حلال پیموده تقسیم میکنند. این مسافت را با خط شروع یکسانی میسنجند.

کروماتوگرافی گازی

 کروماتوگرافی گازی در سال 1952 به وسیله جیمز و مارتین برای جدا کردن مقادیر کم اسیدهای چرب به کار برده شد. GC یک روش فیزیکی است که برای جداسازی، شناسایی و اندازه‌گیری اجزای فرار به کار می‌رود. به عنوان مثال جدا کردن بنزن (نقطه جوش °1/80) از سیلکوهگزان (نقطه جوش °8/80) بوسیله تقطیر جزء به جزء غیر ممکن است. در صورتی که آنها را در چند دقیقه می‌توان به کمک کروماتوگرافی گازی جدا نمود و شناسایی کرد. همچنین حدود 200 جزء مختلف نفت خام را به آسانی می‌توان تشخیص داد. این روش سریع و ساده است و برای تشخیص ناخالصی‌های موجود در یک ماده فرار یا مقادیر کم مواد ضد آفت در پوست میوه‌جات و اندازه‌گیری گازها و آلودگی مواد به کار می رود .
در کروماتوگرافی گازی، فاز متحرک یک گاز است. فاز ساکن یک مادة جاذب جامد یا مایع پوشش داده شده و یا دارای پیوند با یک جامد بر روی دیواره ستون است. اگر فاز ساکن جامد باشد، روش را کروماتوگرافی گاز- جامد (GSC) و اگر فاز ساکن مایع باشد، روش را کروماتوگرافی گاز- مایع (GLC) می‌نامند. هر چند هر دو روش در تجزیه به کار می‌روند ولی GLC بیشتر مورد استفاده قرار می‌گیرد.
جدا شدن اجزای یک نمونه فرار در GLC بر اساس تقسیم آنها بین دو فاز مایع و گاز است. نمونه در فاز متحرک حل شده و فاز ساکن یک مایع دیرجوش است که به صورت لایة نازکی بر روی ذرات یک جامد گسترده شده است.  
گاز حامل باید یک گاز بی‌اثر باشد تا با فاز ساکن، حلال و یا نمونه واکنش ندهد، به همین دلیل معمولاَ از نیتروژن یا هلیم استفاده می‌شود. در دمای ثابت، فشار و سرعت جریان گاز به طرف ستون را با تنظیم کنندة فشار و جریان سنج، ثابت نگه می‌دارند. مقدار µL 1/0-5 از نمونه مایع به وسیله یک سرنگ مخصوص وارد قسمت تزریق نمونه می‌شود. نمونه‌های جامد را باید در یک حلال فرار مناسب،‌ حل و سپس تزریق نمود. برای نمونه‌های گازی باید حجم‌های بیشتری انتخاب شود. نمونه پس از تزریق در نتیجة گرمای حاصل از سیستم الکتریکی تبدیل به گاز می‌شود و با گاز حامل مخلوط شده، به طرف ستون می‌رود.
فاز ساکن یک مایع دیرجوش مانند روغن پارافین یا روغن سیلیکون است که تا حدود 400 مقاوم است و به صورت لایه نازکی روی ذرات جامد گسترده شده است. مایع به کار رفته باید از نظر شیمیایی غیر فعال بوده و برای اجزای نمونه قابلیت انحلال مختلفی داشته باشد. علاوه بر ستون‌های پر شده می‌توان از ستون‌های مویین به طول حدود cm 10-100 و قطر داخلیcm 0/25-0/32 استفاده نمود که داخل آنها از سلیت پوشیده شده است و فیلم نازکی از مایع دیرجوش بر روی پوشش سیلیسی قرار دارد.
جدا شدن مواد در ستون، نظیر فرایند استخراج است. نمونه که در فاز گاز محلول است از بالای ستون وارد می‌گردد و اجزای آن بر حسب ضریب توزیع خود بین دو فاز مایع و گاز تقسیم می‌شوند. در نتیجه اجزای موجود در نمونه بر حسب تمایلی که ستون برای نگهداری آنها دارد از یکدیگر جدا شده و به وسیله عبور گاز حامل،‌ اجزا جدا می‌شوند و به ترتیبی که متناسب با عکس تمایل نگهداری ستون برای آنها است، از انتهای ستون خارج شده، وارد آشکارساز می‌گردند. در آشکارساز اجزاء جدا شده موجود در گاز حامل مورد شناسایی و اندازه‌گیری قرار می‌گیرند.
دمای ستون GC را می‌توان روی دمای خاصی تنظیم کرده و به صورت همدما جداسازی را انجام داد. همچنین در برخی موارد که اجزای نمونه در ستون به خوبی جدا نمی‌شوند، برای جداسازی بهتر از روش برنامه‌ریزی دمایی استفاده می‌شود. در این روش دمای ستون را طبق برنامه‌ای از پیش تعیین شده و با سرعتی مناسب افزایش می‌دهند تا مواد به تدریج از یکدیگر جدا شوند.

 


ز
چهارشنبه 4 اردیبهشت 1392 01:42 ب.ظ
با سلام و خسته نباشیدمن جهت پایان نامه نیاز به تزریق نمونه در دستگاه GC-Mass دارم.ولی آشنائی با این دستگاه و مراکزی که این کاررا انجام میدهند ندارم.میشه در این زمینه کمکم کنید؟
پاسخ : با سلام در بیشتر دانشگاه ها گروه های شیمی، بهداشت محیط و بیوشیمی این دستگاه را دارند ولی اگه تهران هستید می تونید با مراجعه به سازمان انرژی اتمی انتهای کارگر شمالی این تست را انجام بدید
leila
شنبه 25 آذر 1391 12:23 ق.ظ
mamnoon ali bud.movafagh bashid
پنجشنبه 9 آذر 1391 05:32 ب.ظ
سلام .خسته نباشید. من برای کار تحقیقاتی خودم به اطلاعاتی نطیر اینکه مصرف همزمان چه داروهایی خطرناک است و یا اینکه دوز مصرف چه داروهایی حتما باید با دقت تعیین گردد و اندازه گیری آنها در پلاسما و خون لازم و حیاتی است، دارم.لطفا اگر نام کتاب یا مرجعی که بتواند کمکم کند میشناسید برایم میل کنید.از لطفتان سپاسگذارم.
پاسخ : میتونین کتاب تداخلات دارویی دیوید اس تترو ترجمه دکتر جمشید نارنج کار رو مطالعه کنید
 
لبخندناراحتچشمک
نیشخندبغلسوال
قلبخجالتزبان
ماچتعجبعصبانی
عینکشیطانگریه
خندهقهقههخداحافظ
سبزقهرهورا
دستگلتفکر