تبلیغات
سم شناسی دانشگاه تربیت مدرس - لیپید پراکسیداسیون
چهارشنبه 16 آذر 1390

لیپید پراکسیداسیون

   نوشته شده توسط:    

نوشته شده توسط: عماد جعفرزاده

برای بررسی لیپید پراکسیداسیون جهت ارزیابی اکسیداتیو استرس ،از اندازه گیری میزان مالون دی آلدئید(MDA) تولید شده در فرایند لیپید پراکسیداسیون استفاده می گردد . مالون دی آلدئید از پراکسیداسیون لیپیدها تولید می شود و میزان تولید آن با شکست و تفکیک اسیدهای چرب غیراشباع متناسب است. ازاینرو اندازه گیری  MDAاندیکاتور و شاخص مناسبی برای لیپید پراکسیداسیون می باشد . در این روش 2 مولکول باربیتوریک اسید با یک مولکول در محیط اسیدی واکنش می دهد و رنگ صورتی تولید می کند که رنگ صورتی تولید شده در طول موج 532-535 نانومتر دارای جذب بوده و شدت جذب بدست آمده در این طول موج متناسب با تشکیل کمپلکس   TBA-MDA می باشد.

-مواد لازم جهت اندازه گیری لیپید پراکسیداسیون

-بوتیلات هیدروکسی تولوئن  (BHT)                                 100میلی مولار

-EDTA                                                                     10میکرومولار 

-تری کلرواستیک اسید(TCA)                                           

-واکنشگر تیوباربیتوریک اسید(TBARS reagent)                4X

-استاندارد مالون دی آلدئید(MDA standard)                                                                                                                                                                                                 

-الکل مطلق

-طرز تهیه محلول واکنشگر تیوباربیتوریک اسید              TBA/TCA/HCL    

جهت ساخت محلول تیوباربیتوریک اسید 4X 150 گرم تری کلرواستیک اسید را با آب مقطر به حجم 500 میلی لیتر می رسانیم و اجازه می دهیم تا کاملا حل گردد سپس 20.8 میلی لیتر اسیدکلریدریک غلیظ و 3.7 گرم تیوباربیتوریک اسید به آن اضافه می کنیم و با کمک آب مقطر حجم نهایی را به 1000 میلی لیتر می رسانیم و در دمای 70˚C حرارت می دهیم تا کاملا یکدست شود.

روش انجام آزمایش

توجه: ما در اینجا به بررسی تاثیر عصاره تام گیاه بادرنجبویه و فراکسیون فنلی و غیر فنلی آن بر لیپید پراکسیداسیون ناشی پپتید بتا آمیلوئید در سلول های PC12 می پردازیم:

این آزمایش شامل 6 گروه می باشد که گروهی که هیچ ماده ای نمی گیرد به عنوان گروه  کنترل گروه بتا آمیلوئید که در آن سلول ها با غلظت  20 میکرومول از پپتید بتا آمیلوئید مواجهه می گردند. گروه عصاره تام که در آن سلول ها با غلظت 10ppm عصاره تام و گروه عصاره تام و بتا آمیلوئید که با غلظت  20 میکرومول پپتید بتا آمیلوئید و غلظت 10ppm عصاره تام مواجهه می گردند. گروه عصاره فنلی که در آن سلول ها با غلظت 1ppm عصاره فنلی مواجهه می شوند و گروه عصاره فنلی و بتا آمیلوئید که با غلظت  20 میکرومول پپتید بتا آمیلوئید و غلظت 10ppm عصاره تام مواجهه می گردند(عصاره غیر فنلی به علت اینکه اثر حفاظتی در برابر پپتید بتا آمیلوئید نداشت مورد استفاده قرار نگرفت). به منظور اندازه گیری لیپید پراکسیداسیون ،0100 میکرولیتر سوسپانسیون حاوی 1×106  سلول در هر میلی لیتر به هر چاهک از پلیت 6 خانه ای کوت شده بوسیله PDL انتقال داده می شود. پلیت را در انکوباتور با دمای˚C37 و فشار CO2 %5 قرار داده و بعد از 24 ساعت پپتید بتا آمیلوئید و عصاره گیاهی با غلظت های 10 ppm از عصاره تام و 1 ppm از عصاره فنلی تهیه شده و به آن اضافه می گردد برای این منظور ابتدا سلول ها را با غلظت های یاد شده از گیاه مواجهه کرده و به مدت یک ساعت انکوبه می کنیم. سپس پلیت را از انکوباتور خارج کرده و محیط روئی هر خانه را دور ریخته و سلول ها را با پپتید بتا آمیلوئید و عصاره گیاهی با غلظت های 10 ppm از عصاره تام و 1 ppm از عصاره فنلی مواجهه می کنیم.

بعد از مواجهه کردن سلول ها با مواد مورد نظر پلیت به مدت 24 ساعت در انکوباتور قرار داده می شود. بعداز 24 ساعت محلول روئی سلول ها بوسیله سمپلر برداشته می شود. اینکار باید به آرامی صورت بپذیرد. سلول ها را با PBS شسته و PBS را خالی می کنیم. سپس برای برداشتن و جدا کردن سلول ها از پلیت  300 میکرولیتر از محلول EDTA 10 میکرومولار را در هر چاهک می ریزیم. اینکار را به صورت جداگانه در دو حجم 150 میکرولیتری انجام داده  و هر بار اجازه می دهیم که EDTA چندین دقیقه با سلول ها مواجهه داشته باشد. برای هر جداکردن سلول ها و ریختن آنها به درون میکروتیوپ خوب پیپتاژ می کنیم تا مطمئن شویم سلول ها برداشته شده اند. باید همه میکروتیوپ یه خوبی برچسب خورده باشند.

بعداز آنکه سلول ها را خوب جدا کرده و به درون میکروتیوپ منتقل کردیم 10 میکرولیتر از محلول 100 میلی مولار BHT به آنها اضافه می کنیم.BHT به عنوان یک عامل آنتی اکسیدان و احیا کننده عمل می کند. میکروتیوپ ها را به درون فریزر -20˚C منتقل کرده و اجازه می دهیم تا به مدت 24 ساعت در فریزر باقی بمانند.

سپس برای لیز کردن سلول ها آنها را از فریزر بیرون آورده و به مدت 20 ثانیه در 40 ولت سونیکیت می کنیم. سپس 100 میکرولیتر از محلول روئی را برای مراحل بعدی آزمایش برمی داریم. از این نمونه ها برای آزمایش برادفورد و محاسبه پروتئین استفاده می گردد..

سپس 200 میکرولیتر از واکنشگر تیوباربیتوریک اسید را به 100 میکرولیتر نمونه اضافه می کنیم. برای تهیه بلانک 200 میکرولیتر از واکنشگر تیوباربیتوریک اسید را به 100 میکرولیتر EDTA و برای تهیه استاندارد 200 میکرولیتر از واکنشگر تیوباربیتوریک اسید را به 100 میکرولیتر استاندارد مالون دی آلدئید اضافه می کنیم.

در مرحله بعد میکروتیوپ ها را به مدت 60 دقیقه در دمای 90˚C حرارت می دهیم تا پیوند بین MDA-TBA ایجاد گردد. سپس میکروتیوپ ها را در یخ قرار داده و در دور 5 هزار g به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ می شود و در انتها در ته میکروتیوپ ها که حاوی نمونه هستند رسوب پروتئین ها مشاهده می گردد. 100 میکرولیتر از محلول روئی هر میکروتیوپ را برداشته و در پلیت 96 خانه می ریزیم و آنرا با الایزا ریدر در طول موج 540 نانومتر می خوانیم.(تمامی آزمایشات به صورت سه بار تکرار می باشد)

رسم منحنی استاندارد مالون دی آلدئید

برای رسم منحنی استاندارد، از استاندارد مالون دی آلدئید استفاده می کنیم و آنرا در غلظت های مختلف تهیه می کنیم. برای این منظور ابتدا محلول استوک استاندارد مالون دی آلدئید با غلظت 500 میکرومول تهیه گردید سپس غلظت های 1، 5 ، 10 و 12.5 را درست کرده ومنحنی استاندارد را رسم می کنیم.


سعید
یکشنبه 27 آذر 1390 05:42 ب.ظ
مرسی برای توضیحات
دانشجوی دامپزشکی
 
لبخندناراحتچشمک
نیشخندبغلسوال
قلبخجالتزبان
ماچتعجبعصبانی
عینکشیطانگریه
خندهقهقههخداحافظ
سبزقهرهورا
دستگلتفکر