تبلیغات
سم شناسی دانشگاه تربیت مدرس - . تست مهار آنزیم کولین استراز و برادفورد
دوشنبه 6 مهر 1394

. تست مهار آنزیم کولین استراز و برادفورد

   نوشته شده توسط:    

عماد جعفرزاده

. تست مهار آنزیم کولین استراز

 روش Ellman

اساس این روش اندازه گیری سرعت تولید تیوکولین به عنوان محصول کاتالیز آنزیمی به روی استیل تیوکولین به عنوان سوبسترا میباشد. تیوکولین به محض تولید با 5- دی تیو بیس- 2 – نیتروبنزوئیک اسید واکنش میدهد تا آنیون زرد رنگ 5- تیو-2- نیترو بنزوات ایجاد شود. سرعت ایجاد رنگ در طول موج 412 نانومتر به وسیله دستگاه اسپکتروفوتومتر اندازه گیری میشود. واکنش با تیول آنقدر سریع میباشد که مرحله تعیین کننده سرعت تلقی نشود به علاوه واکنشگرهایی که استفاده میشوند در غلظت مورد استفاده باعث مهار آنزیم نمیشوند.

ابتدا در پلیت 6Wellکوت شده 610 سلول کشت میدهیم مثل روش MTT بعد از 24 ساعت غلظت داروی مورد نظر را اضافه میکنیم که ما از غلظت 1 میکرومولار استفاده کردیم واز هر غلظت 4 تا تکرار گذاشتیم یک ساعت بعد دارو بهمراه آمیلوئید بتا 5 میکرو مولار را اضافه میکنیم و در روز سوم ابتدا محیط رویی را خارج میکنیم بعد300 میکرولیتر محلول لیز اضافه و خوب مخلوط میکنیم و از آن فعالیت آنزیم میگیریم.

2 μl ATCI + 5 μl DTNB + 72.5 μl Buffer + سلول لیز شده 72.5:تست

5 μl DTNB + 72.5 μl Buffer+ سلول لیز شده 72.5 μl:کنترل

2 μl ATCI  +   5 μl DTNB  +  72.5 μl Buffer   + بافر لیز سلول  72.5 μl : کنترل


برای اندازه گیری فعالیت آنزیم ابتدا بافرو DTNBو ATCI باهم در پلیت ریخته ودر مرحله آخر  لیز سلولی به آن اضافه می شود و  بلافاصله تغییرات جذب در طول موج 405 بوسیله الایزا ریدر میخوانیم فعالیت آنزیم اندازه گیری شده بر حسب میلی گرم پروتئین موجود در نمونه ها نرمالیزه شده وبه صورت در صد کنترل بیان شده است.

Rate آنزیم را بر بردفورد حال از آن تقسیم کردیم و عدد آن را به صورت درصد کنترل بیان کردیم .

 

(µmol/min) = [ΔA/Δt (rate) × 7.35 × final volume of reading sample(ml)]/100 فعالیت آنزیم

و

% inhibition of enzyme = 100 - % activity of enzyme

 

 

روش انجام آزمایش میکروبرادفورد

از محلول استاندارد پروتئین که در مرحله قبل ساخته شد، رقتهای متوالی[1] در غلظتهای µg/ml 100، 200، 400، 600، 800 و1000 تهیه شده و 5 میکرولیتر در هر چاهک پلیت 96 خانه ریخته شد، سپس 250 میکرولیتر معرف برادفورد به آن اضافه و به آرامی مخلوط گردید و پس از گذشت 5 الی 15 دقیقه جذب آنها در طول موج 595 نانومتر خوانده میشود. در هنگام انجام روش برادفورد نکات زیر باید رعایت شود:

- نمونههای استاندارد و نمونههای مجهول باید به صورت دوتایی[2] باشند.

- تمام استانداردها و نمونهها قبل از اضافه شدن برادفورد مخلوط شدند.

- غلظت نمونه مجهول طوری انتخاب گردد که جذب آنها وسط منحنی استاندارد بیافتد در غیر این صورت نمونه رقیق یا تغلیظ گردد.

- معرف برادفورد در مرحله آخر اضافه شود تا از رسوب آن جلوگیری شود.

- پروتئینها با معرف برادفورد بین 2 دقیقه تا یک ساعت پایدار خواهند بود، ولی بهترین زمان قرائت آن بین 20- 10 دقیقه میباشد.



[1]- serial dilution

[2]- duplicate


 
لبخندناراحتچشمک
نیشخندبغلسوال
قلبخجالتزبان
ماچتعجبعصبانی
عینکشیطانگریه
خندهقهقههخداحافظ
سبزقهرهورا
دستگلتفکر