تبلیغات
سم شناسی دانشگاه تربیت مدرس - MTT assay
پنجشنبه 15 اردیبهشت 1390

MTT assay

   نوشته شده توسط:    

اندازه گیری حیات، رشد و تکثیر سلولها کاربردهای مختلفی در تحقیقات دارد. یکی از قدیمی ترین روشها رنگ آمیزی سلولها با تریپان بلو است که حساسیت کافی نداشته و نیاز به بررسی میکروسکوپی دارد. روشهای دیگری نظیر اندازه گیری میزان كل اسیدهای هسته ای و میزان پروتئین در لیزات سلولی نیز از دقت كافی برخوردار نمی باشند.

 

اندازه گیری جذب مواد رادیواکتیو توسط سلولهای در حال رشد روش دقیقی است. تركیباتی نظیر تیمیدین نشاندار شده با تریتیوم و 5- برومودئواكسی اوریدین هنگام پرولیفراسیون سلول وارد ساختمان هسته سلول شده و باعث نشاندار شدن سلولها می شوند. اما این روش نیز وقت گیر بوده و بعلاوه نیازمند هاروست کردن سلولها پس از تحریک سلولی است. همچنین مشکلات مربوط به کار با مواد رادیواکتیو نظیر دفع مواد باقی مانده و حفاظت از اشعه را نیز به دنبال دارد.

در سال 1983 آزمایش MTT بعنوان جایگزینی برای روش رادیواکتیو پیشنهاد شد. در این روش آنزیماتیک بعنوان سوبسترای واكنش از نمكهای محلول تترازولیوم كه مهمترین آنها MTT است استفاده می شود. بوسیله این آزمایش ساده و دقیق می توان پاسخ سلولهای مختلف را به فاکتورهای خارجی از جمله فاکتورهای رشد، داروهای سایتوتوکسیک و سایر عوامل شیمیائی ارزیابی کرد. بطوریکه میزان فعالیت و سرعت تکثیر سلولها ممکن است تحت تاثیر هورمونها، فاکتورهای رشد، سایتوكینها و میتوژنها افزایش یافته یا تغییری نکند. همچنین تحت تاثیر بعضی از داروها و عوامل سایتوتوکسیک نظیر داروهای ضد سرطان ممکن است سلولها دچار نکروز یا آپپوپتوز شده و سرعت تکثیر یا رشدشان کاهش یابد.

 

آزمایش MTT که یک روش رنگ سنجی است که بر اساس احیا شدن و شكسته شدن كریستالهای زرد رنگ تترازولیوم با فورمول شیمیائی3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)

 

این روش نسبت به سایر روشهای بررسی پرولیفراسیون سلولی ساده تر بوده و با امكانات موجود در اغلب آزمایشگاهها قابل اجراست. بعلاوه کلیه مراحل آزمایش در پلیتهای 96 خانه کشت سلولی انجام شده و نتایج با دستگاه الیزا ریدر قرائت می شود لذا تعداد زیادی نمونه را می توان همزمان آزمایش کرد.

اساس تست MTT :

بوسیله آنزیم سوكسینات دهیدروژناز و تشكیل کریستالهای آبی رنگ نامحلول انجام می شود. در این روش برخلاف سایر روشها مراحل شستشو و هاروست كردن سلول كه اغلب باعث از دست رفتن تعدادی از سلولها می شوند حذف شده اند و تمام مراحل آزمایش از ابتدای كشت سلولی تا قرائت نتایج با فتومتر، در یك میكروپلیت انجام می شوند لذا تکرار پذیری، دقت و حساسیت آزمایش بالا است. بطور کلی سلولها در محیط کشت به دو صورت چسبیده به پلیت (Attached) و شناور (suspended) دیده می شوند. در صورتی که آزمایش روی سلولهای چسبیده به پلیت نظیر سلولهای توموری و فیبروبلاستها انجام شود ابتدا بایستی تعداد مناسبی سلول (ترجیحا 5000 سلول در هر چاهک) را در هر یک از چاهکها کشت داده اجازه داد تا سلولها به کف پلیت چسبیده و بحالت پایدار خود درآیند. سپس چاهکهای کنترل و آزمایش انتخاب شده و مقدار مناسبی از ماده میتوژن یا داروی مورد نظر را به چاهکهای تست اضافه می کنیم و پلیت را تا زمان مورد نیاز جهت تاثیر ماده مورد نظر، انکوبه می کنیم. پس از اتمام زمان انکوباسیون محیط كشت روئی را دور ریخته به هر چاهك 200 میكرولیتر محیط كشت حاوی نیم میلیگرم در میلی لیتر محلول MTT اضافه نموده و به مدت 2 تا 4 ساعت در انكوباتورCO2 در 37 درجه سانتیگراد قرار می دهیم. در طی زمان انکوباسیون MTT توسط سیستم سوكسینات دهیدروژناز كه یكی از آنزیمهای چرخه تنفسی میتوكندریهاست احیا می شود. احیا و شکسته شدن این حلقه موجب تولید کریستالهای آبی رنگ فورمازان می شود که در زیر میکروسکوپ براحتی قابل تشخیص هستند. میزان رنگ تولید شده با تعداد سلولهایی كه از نظر متابولیك فعال هستند رابطه مستقیم دارد. کریستالهای فورمازان در آب غیرمحلول بوده و بایستی قبل از رنگ سنجی توسط ماده حلالی نظیر DMSO بحالت محلول درآیند. در نهایت جذب نوری محلول بدست آمده را می توان در طول موج 570 نانومتر قرائت کرده و به کمک منحنی استاندارد تعداد سلولها را محاسبه نمود. برای هر رده سلولی ارتباط خطی بین تعداد سلولها و جذب نوری محلول نهائی وجود دارد لذا جهت بررسی هر نوع سلول بایستی منحنی استاندارد مربوط به همان رده را رسم نموده و استفاده کرد.

انجام آزمایش روی سلولهای معلق یک اختلاف جزئی با سلولهای چسبیده دارد. در مورد سلولهای هیبریدوما تعداد 5000 سلول در هر چاهک برای آزمایش مناسب است. اما در مورد لنفوسیتهای انسانی ده برابر سلول بیشتری لازم داریم و معمولا بتعداد 25000 تا 250000 سلول در هر چاهک رنگ نهائی مناسبی می دهد. در مورد سلولهای معلق باید پس از اتمام مراحل كار كشت سلولی پلیت را در سانتریفیوژ مخصوص قرار داده و در دور 1000-2000 دور در دقیقه سانتریفیوژ نمود تا سلولهای معلق در كف پلیت رسوب كنند. در صورت لزوم می توان سلولها را با الكل یا فرمالدئید در كف پلیت فیكس نمود. عمل فیكساسیون بایستی در زمان كوتاهی انجام شود تا خصوصیات آنزیمی سلولها حفظ گردد. سپس سلولها را با PBS سرد شستشو داده و بر روی آنها محیط كشت حاوی MTT می افزائیم. بقیه مراحل شبیه سلولهای چسبیده می باشد.

برای تهیه منحنی استاندارد ابتدا یك سوسپانسیون سلولی با غلظت كاملاً مشخص مثلاً یك میلیون سلول در میلی لیتر از سلولهای مورد نظر تهیه كرده و پس از بررسی ویابیلیتی آنها مقادیر مشخص و فزاینده ای از آن را بصورت quadriuplicate در پلیت 96 حفره ای كشت سلولی كشت می دهیم. سپس این پلیت را به انكوباتور CO2 منتقل نموده و 24 ساعت بعد تست MTT انجام داده و با بدست آوردن مقادیر جذب نوری در مقابل تعداد سلول مربوطه منحنی استاندارد را رسم می کنیم.

نوشته شده توسط جابرظفری واحسان صحرایی


یاسر
جمعه 17 شهریور 1396 01:59 ب.ظ
استفاده کردیم؛
ممنون از لطف شما
چهارشنبه 15 شهریور 1396 02:02 ق.ظ
سلام ممنون بخاطر این مطلب
اگر امکانش هست در مورد روش srp هم توضیح بدهید
سه شنبه 10 مرداد 1396 11:35 ق.ظ
ممنون از بیان ساده و روان مطالب
محمد
چهارشنبه 31 خرداد 1396 01:00 ق.ظ
سلام وخسته نباشید
ایا کسی میتواند بگوید که چطوری باید از بید های هیدروژلی تست MTT گرفت؟
بیدها به شد متورم میشوند ونامحلول دراب هستند

لطفا اگر ممکنه به ایمیل جواب بدید
باتشکر
علیرضا ریاحی
پنجشنبه 30 دی 1395 08:23 ب.ظ
خیلی ممنونم،خدا حفظت کنه
علیرضا ریاحی
پنجشنبه 23 دی 1395 02:45 ب.ظ
لطفا رفرنس فارسی و انگلیسی برای mtt معرفی بفرمائید
با تشکر
پاسخ : Hwang JH, Takagi M, Murakami H, Sekido Y, Shin-ya K. Induction of tubulin polymerization and apoptosis in malignant mesothelioma cells by a newcompound JBIR-23. Cancer Letters 2011; 300(2):189-96.
داوودی
پنجشنبه 3 تیر 1395 10:25 ب.ظ
ممنون میشم رفرنس رو برای من هم بفرستید
پاسخ : فرستاده شد.
سپیده
جمعه 30 بهمن 1394 02:03 ب.ظ
با سلام و خسته نباشید لطفا رفرنس فارسی و انگلیسی برای تست mtt معرفی کنید. ممنون
پاسخ : ایمیل شد.

سید موسی متولی حقی
یکشنبه 8 شهریور 1394 07:08 ب.ظ
ممنونم . عالی بود
پاسخ : خاهش میکنم
جمعه 3 بهمن 1393 09:17 ب.ظ
متشکرم خیلی عالی بود
پاسخ : نوش جان
یکشنبه 7 اردیبهشت 1393 02:12 ق.ظ
آزاده
شنبه 19 بهمن 1392 12:07 ق.ظ
با سلام لطفاً رفرنس انگلیسی و فارسی برای تست mtt معرفی کنید در صورت امکان به ایمیلم بفرستید.ممنون
پاسخ : ارسال شد
=
دوشنبه 6 آبان 1392 11:18 ب.ظ
سلام با تشكر لطفا رفرنس (ترجیحا فارسی) و توضیحات بیشتر ارسال می كنید؟ بسیار ممنون میشوم
پاسخ : پاسخ داده شد به ایمیلتون
مریم
سه شنبه 5 شهریور 1392 04:52 ب.ظ
باسلام و تشکر من هم رفرنس مطلب را لازم دارم اگر ممکن است برای من هم ایمیل کنید ممنون
پاسخ : فرستاده شد.
سحر
دوشنبه 14 مرداد 1392 12:20 ب.ظ
سلام من سمیت یک سری مواد رنگی رو روی سلولهای لنفوسیت نرمال بررسی می کنم از خون تازه سلول جدا می کنم 10000 تا سلول در هر چاله24 ساعت بعد 100میکرولیتر نمونه و در زمان های 24،48،72 مقدار 20میکرولیتر mtt و 4 ساعت بعد 100میکرو dmso اضافه می کنم و کنترلم رو 100میکرو سلول 100میکرو نمونه و 20 mtt و 100میکروdmso اضافه کردم. چندبار تکرار کردم نتایج خیلی منطقی نیست خواستم ببینم توی انجام روش اشتباه کردم یا نه؟
پاسخ : پاسخ داده شد به ایمیلتون
sakine
جمعه 7 تیر 1392 12:12 ب.ظ
سلام مفیدبود ولی من رفرنس برای این تست میخام و اینکه توضیح بیشتردرباره ایت تست درموردسلولهای بنیادی مغزاستخوان.تشکر
پاسخ : به ایمیلتون فرستاده شد.
bahram
پنجشنبه 26 بهمن 1391 08:27 ب.ظ
سلام
خسته نباشید
لطفارفرنس فارسی برای این تست معرفی کنید(ایمیل)
با تشکر
پاسخ : فرستاده شد
bahram
پنجشنبه 26 بهمن 1391 08:20 ب.ظ
سلام
خسته نباشید
لطفارفرنس فارسی برای این تست معرفی کنید(ایمیل)
با تشکر
پاسخ : ایمیل شد
mina
دوشنبه 10 مرداد 1390 05:48 ب.ظ
jaleb bood va mofid :)
 
لبخندناراحتچشمک
نیشخندبغلسوال
قلبخجالتزبان
ماچتعجبعصبانی
عینکشیطانگریه
خندهقهقههخداحافظ
سبزقهرهورا
دستگلتفکر