تبلیغات
سم شناسی دانشگاه تربیت مدرس - مطالب مهر 1394
دوشنبه 6 مهر 1394

. تست مهار آنزیم کولین استراز و برادفورد

   نوشته شده توسط:    

عماد جعفرزاده

. تست مهار آنزیم کولین استراز

 روش Ellman

اساس این روش اندازه گیری سرعت تولید تیوکولین به عنوان محصول کاتالیز آنزیمی به روی استیل تیوکولین به عنوان سوبسترا میباشد. تیوکولین به محض تولید با 5- دی تیو بیس- 2 – نیتروبنزوئیک اسید واکنش میدهد تا آنیون زرد رنگ 5- تیو-2- نیترو بنزوات ایجاد شود. سرعت ایجاد رنگ در طول موج 412 نانومتر به وسیله دستگاه اسپکتروفوتومتر اندازه گیری میشود. واکنش با تیول آنقدر سریع میباشد که مرحله تعیین کننده سرعت تلقی نشود به علاوه واکنشگرهایی که استفاده میشوند در غلظت مورد استفاده باعث مهار آنزیم نمیشوند.

ابتدا در پلیت 6Wellکوت شده 610 سلول کشت میدهیم مثل روش MTT بعد از 24 ساعت غلظت داروی مورد نظر را اضافه میکنیم که ما از غلظت 1 میکرومولار استفاده کردیم واز هر غلظت 4 تا تکرار گذاشتیم یک ساعت بعد دارو بهمراه آمیلوئید بتا 5 میکرو مولار را اضافه میکنیم و در روز سوم ابتدا محیط رویی را خارج میکنیم بعد300 میکرولیتر محلول لیز اضافه و خوب مخلوط میکنیم و از آن فعالیت آنزیم میگیریم.

2 μl ATCI + 5 μl DTNB + 72.5 μl Buffer + سلول لیز شده 72.5:تست

5 μl DTNB + 72.5 μl Buffer+ سلول لیز شده 72.5 μl:کنترل

2 μl ATCI  +   5 μl DTNB  +  72.5 μl Buffer   + بافر لیز سلول  72.5 μl : کنترل



ادامه مطلب

دوشنبه 6 مهر 1394

سیستم کولینرژیک (1) استیل کولین استراز

   نوشته شده توسط:    

عماد جعفرزاده

. استیل کولین استراز

استیل کولین استراز یک پروتئین 60 کیلو دالتونی بوده و به خانواده آلفا / بتا هیدرولازها متعلق است. بسته به ساختار به شکلهای گوناگون و از نظر مکانی به شکل داخل و خارج سلولی موجود است. استیل کولین استراز سیتوزولی مسئول حذف استیل کولین اضافه در داخل سلول است و استیل کولین موجود در فضای سیناپسی یا فضای بین عصب و عضله به وسیله آنزیم خارج سلولی تجزیه میشود.این آنزیم از لحاظ ساختاری مانند تمام آلفا / بتا هیدرولازها از 12 بتا شیت و 14 آلفا هلیکس تشکیل شده است. با توجه به ساختار آنزیم (TcAChE)[1] که به وسیله X-Ray کریستالوگرافی به دست آمده وجود یک حفره دراز به طول Å 20 که به سایت فعال آنزیم ختم میشود به اثبات رسیده است. این حفره به وسیله اسیدهای آمینه آروماتیک حفظ شدهای احاطه میگردد و پهنای آن به Å 5 در حد فاصلTyr121 وPhe330 میرسد. با توجه به اینکه قطر بخش کواترنری استیل کولین Å 6.4 میباشد، در حین قرارگیری سوبسترا در جایگاه فعال آنزیم تغییرات ساختاری در آنزیم رخ میدهد.

بر اساس مدلهای بدست آمده در مطالعات کینتیکی حداقل دو جایگاه فعال برای آنزیم وجود دارد: یکی به نام جایگاه کاتالیتیکی در کف حفره و دیگری با نام PAS[2] در مدخل ورودی حفره. جایگاه فعال از دو زیر جایگاه تشکیل شده است: زیرجایگاه استری و زیر جایگاه کاتالیتیک آنیونی (CAS). زیر جایگاه استری در آنزیم شامل سه گانه کاتالیتیک سرین-هیدرولازSer200- His440- Glu327 در TcAChE و Ser203- His447- Glu33در AChE پستانداران میباشد.

چندین بخش مهم در آنزیم وجود دارند که در اتصال سوبسترا به آنزیم استیل کولین استراز نقش دارند؛ شامل حفره اکسی آنیونی تشکیل شده از Gly118, Gly119 و Ala201 و پاکت آسیلی که از Trp233, Phe288, Phe290 Phe331 تشکیل شده است.CAS فاقد اسید آمینه با بار منفی است اما حلقه ایندول درTrp84, Glu199 وPhe330 میتواند با بخش کواترنری سوبسترا پیوند از نوع cation-π ایجاد کند. مهار کنندههای آنزیم با اتصال به جایگاه فعال با تمایل بالا مثل تاکرین و یا از طریق اتصال برگشت ناپذیر به آنزیم مثل ارگانو فسفره ها آن را غیر فعال و مهار میکنند.


ادامه مطلب

دوشنبه 6 مهر 1394

سیستم کولینرژیک استیل کولین

   نوشته شده توسط:    

عماد جعفرزاده


استیل کولین یکی از قدیمیترین و شناخته شده ترین میانجیهای عصبی در سیستم اعصاب مرکزی پستانداران میباشد. استیل کولین در نورونهای کولینرژیک که در نقاط مختلف مغز پراکندهاند ساخته و ذخیره میشود. از بین رفتن یا عدم فعالیت نورونهای کولینرژیک در ایجاد بیماریهای مختلفی از جمله آلزایمر وهانتینگتون دخیل میباشد. استیل کولین ساخته شده در این نورونها در اثر ایجاد تحریک عصبی به فضای سیناپسی یا فضای بین عصب و عضله ترشح شده و بر روی گیرندههای نیکوتینی یا موسکارینی مربوط اثر میکند. پس از پایان تحریک عصبی مقادیر اضافه استیل کولین باید به طریقی پاک شود که این فرایند از طریق تجزیه آنزیمی صورت میگیرد و آنزیم دخیل استیل کولین استراز نام دارد.

در مغز پستاندران دو نوع گیرنده برای استیل کولین وجود دارد:نیکوتینی و موسکارینی.مطالعات اخیر از ارتباط بین نقص عملکرد رسپتور نیکوتینی استیل کولین (nAChRs) و بیماریهای نورودجنرتیو مثل آلزایمر-صرع-اسکیزوفرنی وپارکینسون حکایت دارد. (nAChRsبیشتر در هیپوکمپ و مناطقی که به عنوان مراکز یادگیری و حافظه است حضور دارد. میتواند به این گیرنده متصل شود وعملکرد آن را مختل کند. اگرچه استفاده از ترکیبات خاص میتواند با این عملکرد مقابله کند.که این ترکیبات در درمان آلزایمر استفاده میشود. سایر داروهایی که برای درمان آلزایمر استفاده میشود مستقیما این گیرنده را تعدیل میکنند

 رسپتورهای استیل کولین

 رسپتورهای موسکارینی

رسپتورهای موسکارینی استیل کولین به خانواده رسپتورهای مزدوج با جی پروتئینها (GPCRs) متعلق میباشد. تا به حال 5 زیرگونه (M1-M5) از آنها شناسایی شده است. زیر گونههای M1 و M3 در نقاط زیر پراکندگی دارند؛ یکی در سطح نورونهای کولینرژیک ناحیه کورتکس و هیپوکامپ و دیگری در نواحی کولینرژیک بین نورونی ناحیه استریاتوم. در کنار این گیرندههای M2 و M4 به طور عمده در آکسون نورونهای ناحیه basal forebrain قرار دارند که در واقع ادامه دهنده سلولهای هدف کولینرژیک در کورتکس و هیپوکامپ میباشند.



ادامه مطلب

دوشنبه 6 مهر 1394

اکسیداتیو استرس

   نوشته شده توسط:    

عماد جعفرزاده

اکسیداتیو استرس نقش بسیار مهمی در پیشبرد بیماری ایجاد میکند .

مصرف بسیار بالای اکسیژن، وجود مقادیر بالای اسیدهای چرب اشباع نشده که هدف رادیکالهای ازاد میباشند، همچنین یونهای فلزی مثل آهن که نقش بسیار مهمی در تشکیل رادیکالهای آزاد دارند در آنجا زیادند، و آنتی اکسیدانها در مغز به مقدار کم وجود دارند.

اگرچه اكسیژن برای حیات ضروری است ولی متابولیسم آن میتواند گونه هائی از مولكول اكسیژن كه به طور نسبی احیاء شدهاند را تولید كند كه میتواند منجر به آسیب سلولی در بسیاری از اعضا شود. سلولها با احیای مولكول اكسیژن به آب انرژی تولید میكنند. در طی این فرآیند، مقادیر كمی از گونههای اكسیژن واكنش دهنده، كه به طور جزیی احیاء شده اند، تولید میشود. این گونهها یك محصول فرعی غیرقابل اجتناب تنفس میتوكندری هستند. برخی از این اشكال رادیكال آزاد هستند كه میتوانند به چربی ها ، پروتئینها و اسیدهای نوكلئیك صدمه برسانند.اینها اصطلاحآ"گونههای فعال اكسیژن "(ROS) نام دارند.سلولهای سیستم ایمنی برای پیشگیری از آسیب ناشی از این گونههای اكسیژن، محصولاتی دارند مانند ویتامین C,A.E گلوتاتیون، سوپراكسید دیسموتاز، گلوتاتیون پراكسیداز و كاتالاز.كه اینها سیستمهای پاكسازی كننده (scavenger) نامیده میشوند.

عدم تعادل بین سیستمهای تولید كننده رادیكال آزاد و سیستمهای پاكسازی كننده منجر به استرس اكسیداتیو شده وضعیتی كه با آسیب سلولی در بسیاری از حالتهای پاتولوژیك همراه میشود. آسیب ناشی از رادیكال آزاد مخصوصاً نوعی كه به دنبال رادیكا لهای آزاد اكسیژن فعال شده رخ میدهد یك مكانیسم مهم آسیب سلولی است.



ادامه مطلب